A Firenze melletti Ponte a Emában jött világra egy gazdálkodó fiaként. A tanulással hamar felhagyott, 13 évesen már egy bicikliműhelyben dolgozott, ekkor indult élete első kerékpárversenyén. Az ígéretes amatőr 1935-ben állt profinak, még abban az évben olasz bajnok lett és magára ölthette az olasz körverseny, a Giro d'Italia legjobb hegyi menőjének járó kék trikót, ezt pályafutása során még hatszor viselhette. Az 1936-os Girót már megnyerte, de örömét beárnyékolta öccse halálos balesete, még a visszavonulását is fontolgatta.
Végül rábeszélték a folytatásra, ezáltal még kétszer - 1937-ben és 1946-ban - diadalmaskodott a Girón és kétszer a Tour de France-on (1938-ban és 1948-ban). Az egynapos versenyeken is kiválóan teljesített, négyszer győzött a Milánó-San Remón, háromszor a lombardiai körversenyen, kétszer a Züri-Metzgetén, négyszer pedig megnyerte az olasz nemzeti bajnokságot. Az 1948-as Touron három egymást követő hegyi szakasz megnyerésével felállított rekordját azóta sem szárnyalták túl, máig ő az egyetlen, aki tíz év elteltével ismét megnyerte a legrangosabb profi kerékpáros körversenyt.
A kiváló hegyi menő Bartali sajátos stílusban kerekezett: még a hegymenetek során is szinte végig a nyeregben ült, csak ritkán "táncolt" a pedálokon. Ülve maradt akkor is, amikor támadták, csupán lehajolt és sebességet váltott, az elsők között használta az akkor újdonságként kifejlesztett fogaskerekes váltót.
1940-ben a Legnano csapat vezetője szerződtette mellé az ifjú tehetséget, Fausto Coppit, aki - nem sok tiszteletet tanúsítva a sztár iránt - rögtön megnyerte az olasz körversenyt. Ekkor kezdődött kettejük csatája, egy csapatban, de egymás ellen versenyeztek, Bartali még kémkedett is Coppi után. A vetélkedés Olaszországot is megosztotta, a konzervatív déliek Bartalit, a világiasabb északiak Coppit favorizálták. Rivalizálásuk az 1949-es Touron szelídült együttműködéssé, kölcsönös udvariassági gesztusok után Coppi az első, Bartali a második helyen végzett.
Az olaszok által csak mesterként (Maestro) ünnepelt, aszkéta életmódja és vallásossága miatt is tisztelt és szeretett Bartali pályafutását a második világháború megszakította. A sportoló részt vett az ellenállási mozgalomban, hírnevét kémjelentések, fotók és hírek szállítására és zsidómentésre használta (ez utóbbi csak halála után, 2000-ben került nyilvánosságra). Edzést színlelve kerekezett Firenzéből Umbriába, a papírokat biciklijébe rejtve hozta-vitte, később utánfutóval embereket is csempészett át a határon - de sem a fasiszta rendőrség, sem a németek nem merték megkockáztatni a letartóztatását megjósolhatóan követő lázongásokat. A dokumentumok tanúsága szerint Bartali több mint 800 olaszországi zsidó megmentését segítette, ezért 2013-ban a Jad Vasem Intézet a Világ Igazainak sorába emelte.
Nyíltan vállalt katolikus hite miatt a "Gino, a jámbor" becenevet kapta. Ő volt a Vatikán kedvenc sportembere, három pápa is személyesen áldotta meg, XXIII. János pápa őt kérte, hogy tanítsa meg biciklizni. Bartali nem csinált titkot belőle, hogy a kereszténydemokrata pártot támogatja, de a kommunisták is őszintén rajongtak érte.
Az 1948-as Touron aratott győzelmével sokak szerint egyenesen a polgárháborútól mentette meg Olaszországot. A verseny ideje alatt Rómában merényletet követtek el a kommunista pártot vezető Palmiro Togliatti ellen, aki súlyosan megsebesült. Az olasz városok utcáit tiltakozó tömegek lepték el, gyárakat foglaltak el, felkelés kitörése fenyegetett, és a parlamentben is egyre feszültebb volt a helyzet. Az érintettek által meg nem erősített legenda szerint Bartalit ekkor felhívta régi ismerőse, a kereszténydemokrata Alcide de Gasperi miniszterelnök, és arra kérte, próbáljon győzni, hátha azzal lecsillapítja a kedélyeket. Bartali a telefonbeszélgetés után egymás után három szakaszt nyert és végül 26 perces előnnyel a versenyt is megnyerte - a győzelmi mámorban az olaszok félresöpörték a politikai nézetkülönbségeket.
A versenyzést 40 éves korában abbahagyta, de az olasz televízió szakkommentátoraként az utolsó pillanatig kapcsolatban maradt sportágával. 2000. május 5-én, 85 éves korában szívinfarktusban halt meg Firenzében. 2006-ban filmet forgattak az életéről Gino Bartali, az acélember címmel.